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實時熒光定量PCR(qPCR)的實驗步驟解析
來源: 時間:2022-12-29 09:33:40 瀏覽:14787次

qPCR: Quantitative Real-time PCR,中文名是實時熒光定量PCRqPCR是一種在DNA擴增反應中,以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應(PCR)循環后產物總量的方法。通過內參對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法。

TakaRa 試劑盒PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time),SYBRGreenⅠ法。

實驗步驟:

一,去除基因組DNA反應:

全波長酶標儀測出RNA濃度(單位ng/ul);按照以下劑量配制10ul體系

試劑使用量
5×gDNA Eraser Buffer2 μl
Buffer 2.0 μl gDNA Eraser1 ul
Total RNA1ug/RNA濃度
RNase Free dH2OUp to10 ul

PCR程序:42℃ 2min

4℃ ∞

二,反轉錄反應:

按照以下劑量配制20ul體系:

試劑使用量
步驟 1 的反應液10 ul
PrimeScript RT Enzyme Mix I1 ul
RT Primer Mi1 ul
5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time)4 ul
RNase Free dH2O4 ul
Total20 ul

PCR程序:37℃ 15min

85℃ 5s

4℃ ∞

三,Real Time PCR

按照以下劑量配制20ul體系:

試劑使用量
SYBR@ Premix Ex TaqII(2X)10 ul
F Primer(10uM)0.8 ul
R Primer(10uM)0.8 ul
ROX Reference II0.4 ul
反應2的DNA模板2 ul
ddH2O6 ul

四,儀器設置

儀器使用的是熒光定量PCR儀Q6-96,設置界面如下圖:

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全部 3小時前 四川
文字是人類用符號記錄表達信息以傳之久遠的方式和工具。現代文字大多是記錄語言的工具。人類往往先有口頭的語言后產生書面文字,很多小語種,有語言但沒有文字。文字的不同體現了國家和民族的書面表達的方式和思維不同。文字使人類進入有歷史記錄的文明社會。
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