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【詳解】HE染色實驗中的常見問題及其處理方法

來源：時間：2024-12-06 10:23:25 瀏覽：17836次

【詳解】HE染色實驗中的常見問題及其處理方法

HE染色（蘇木精-伊紅染色）是組織學、胚胎學和病理學中最常用的技術之一，用于觀察細胞核和細胞質的結構；然而，在實際操作中，常常會遇到各種問題，影響染色結果的質量。

一、基本原理

HE染色法利用蘇木精（堿性染料）和伊紅（酸性染料）分別對細胞核和細胞質進行染色。蘇木精主要使細胞核內的染色質和細胞質內的核酸著紫藍色，而伊紅則使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。通過這種染色方法，可以清晰地觀察到細胞的結構和組織的形態。

二、常見問題及處理方法

（1）著色過深或過淺

1. 原因：染色時間控制不佳，HE染色需要通過鏡檢來控制時間，染色時間過長或過短都會影響染色效果；分化時間不當，過度分化會導致染色太淺，而分化不足則會使染色過深。

2. 處理方法：通過預實驗確定最佳染色時間，一般情況下新鮮蘇木素染色時間在1-3分鐘，分化時間不宜過長；如果染色過深，可以適當縮短蘇木素染色時間，或增加分化時間；如果染色過淺，可以適當延長蘇木素染色時間，或減少分化時間；過度分化后，可以用水洗后重新復染蘇木素。

（2）染色不均

1. 原因：切片厚度不一，切片有褶皺或裂痕，導致過厚或過薄的部分在染色時吸收染液的程度不同；染色時間不足或過長；脫蠟水化不充分；試劑分布不均勻。

2. 處理方法：提高切片技術，確保切片厚度均勻，厚度一般在3-5微米，切片過程中避免產生刀痕和褶皺；嚴格按照標準時間進行染色；脫蠟前確保玻片干透，嚴格按照標準時間把控二甲苯停留時間（二甲苯110分鐘、二甲苯110分鐘）；在染色過程中適當晃動切片，確保試劑均勻分布。

（3）染色后切片不清晰，霧化，斑點

1. 原因：烤片溫度過低，時間不夠，導致脫蠟不徹底，切片留存白色斑點；染色后切片脫水時間不合理，切片上殘留水分，使切片霧化；蓋玻片上殘留封固劑，導致切片不清晰；組織標本已發生自溶或取材后沒及時固定或固定液濃度不夠；固定劑對組織有一定媒染作用，固定不良是造成切片染色模糊不清的主要原因；淋巴結處理不當造成切片染色后組織見發灰現象，主要原因是細胞密集，結構復雜，導致固定液難以滲透到組織深部。

2. 處理方法：提高烤片溫度和時間，確保脫蠟徹底；優化脫水的梯度乙醇時間，切片經過低濃度時時間要短，向高濃度逐漸延長脫水時間；重新封片，確保蓋玻片上沒有殘留封固劑；及時固定組織標本，確保固定液濃度合適；對于淋巴結等復雜組織，可以用等量無水乙醇乙醚混合液處理切片5-10分鐘，乙醇洗，水洗，3%硫酸鐵銨溶液補充媒染5分鐘。

（4）染色后切片有黑色雜質，氣泡

1. 原因：雜質多為蘇木素染色液中的金屬膜粘附于載玻片上；封片過程中產生的氣泡。

2. 處理方法：每天染色前仔細過濾蘇木素染液，或使用半氧化蘇木素染色液；仔細檢查封片過程，確保沒有氣泡產生。可以使用中性樹脂進行封片，防止日后褪色。

（5）細胞核染色過淺

1. 原因：蘇木精染色時間不足，未能使細胞核充分攝取染料；分化時間過長，導致細胞核染色過淺。

2. 處理方法：適當延長蘇木精染色時間，確保細胞核充分染色；減少分化時間，避免過度分化。

（6）細胞質染色不佳

1. 原因：伊紅染色時間不足，未能使細胞質充分攝取染料；伊紅染色液中的pH值不合適。

2. 處理方法：適當延長伊紅染色時間，確保細胞質充分染色；在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸，調節pH值，改善細胞質染色效果。

（7）組織切片收縮、變形

1. 原因：染色過程中切片干燥：導致切片收縮、變形，影響神經元形態。

2. 處理方法：在染色過程中保持切片濕潤，避免切片干燥；切片從二甲苯取出或進入二甲苯前，切片周邊均應擦干凈或吸干多余水分。

（8）封片問題

1. 原因：封片時使用的樹脂濃度不當，可能導致日后褪色；蓋片選擇不當，如漏出一部分組織塊，將會導致褪色。

2. 處理方法：使用中性樹脂進行封片，防止日后褪色；選擇大于組織塊面積的蓋片，確保沒有部分組織塊漏出；確保樹脂濃度適中，封片時沒有氣泡。

三、實驗注意事項

1. 緩沖液的使用：組織切片在染色前必須在適當的緩沖液中浸泡，染色期間pH值應始終穩定。

2. 固定時間：如果組織塊在福爾馬林中固定時間長，組織酸化而影響細胞核著色，需要在自來水中沖洗時間長一些或在飽和碳酸鋰水溶液中處理10-30分鐘。

3. 分色時間：切片染蘇木精后，分色這一步是關鍵，應在顯微鏡下控制進行，一般以細胞核染色清楚而細胞質基本無色為佳。

4. 脫水和透明化：組織切片需要通過一系列的酒精濃度逐漸脫水，并用透明劑如苯酚、二甲苯等進行透明化；透明化后切片會變得更加清晰，便于染色。

5. 洗滌步驟：未充分清洗會導致染色劑殘留，影響結果的質量；每個處理步驟后，應該用足夠的緩沖鹽水徹底洗滌。

6. 避免空氣暴露：空氣中的灰塵和污染物會對實驗產生不利影響，因此在染色過程中，需要避免將切片長時間暴露在空氣中，并保持實驗室的清潔和衛生。

7. 監控染色反應：染色的過程應該密切監測，以便在必要時進行微調；需要管理好每個步驟的時間和溫度，以避免過度染色或染色不足的情況發生。

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